Микроворсинки бактерий. Фимбрии бактерий. F-пили (секс-пили) бактерии. Клеточная оболочка бактерий. Гликокаликс. Микробиология: теория и практика Пили необходимы бактериальным клеткам для

Пили

На поверхности прокариотической клетки часто присутствуют нитевидные образования белковой природы, которые называют пилями или фим- бриями (от латинских слов «волосы», «нити»). Пили грамотрицательных бактерий изучены достаточно подробно, известно также о существовании пилей у грамположительных организмов.

Они отвечают за прикрепление клетки к неживому объекту и к другой клетке, помогают принимать и передавать ДНК при конъюгации, служат акцепторами бактериофагов. Основное же предназначение пилей - поддерживать специфические прикрепительные структуры клетки. Прикрепительные субъединицы (адгезины) часто в качестве минорных компонентов присутствуют на концах пилей, однако основная структура пилей также может выступать в роли адгезина. Адгезины выступают носредниками при бактериальных контактах, при контактах с неживыми объектами, тканями и клетками в восприимчивых организмах. Колонизация тканей хозяина патогенными бактериями обычно зависит от стереохимического подобия между архитектурой адгезина и соответствующего рецептора клетки хозяина. Взаимоотношения, медиируемые адгезивными пилями, могут помогать формированию микробных биопленок и часто являются основным фактором успешной колонизации организма-хозяина патогенными и сапротрофными микроорганизмами. Так, уропатогенные Е. coli для эффективного заселения эпителия мочевого пузыря должны иметь пили типа 1. Эти пили прикрепляются к консервативным рецепторам клеток эпителия мочевого пузыря, содержащим маннозу, и предотвращают вымывание бактерий с мочой. Р-пили осуществляют ту же функцию в почках, препятствуя удалению вызывающих пиелонефрит клеток Е. coli из почек и мочевыводящих каналов. Кишечные патогенные микроорганизмы образуют многочисленные и разнообразные адгезивные пили, которые помогают бактериям колонизировать кишечник. К этой группе принадлежат пили К88, К99, 987Р, длинные полярные фимбрии, плазмид- ные пили Salmonella enterica и агрегирующие фимбрии эитеропатогенных Е. coli. ТС Р-пили ответственны за прикрепление V. cholerae к эпителию тонкого кишечника. Эти же пили действуют как рецепторы для лизогенного фага, кодирующего две субъединицы холерного токсина. Этот фаг переносится в тонком кишечнике между клетками холерного вибриона с помощью ТСР-пилей. Другие пили также помогают в приобретении факторов вирулентности. Поглощение ДНК происходит при помощи пилей типа 4, а перенос ДНК - при посредстве конъюгативных пилей, которые помогают патогенным микроорганизмам приобретать гены, позволяющие синтезировать широкий спектр факторов вирулентности и придающие им устойчивость ко многим антибиотикам. Образование биопленок, требующее во многих случаях участия пилей типа 1, 4 или «кудряшек», также предохраняет патогенные бактерии от действия лекарственных препаратов и может способствовать колонизации тканей и медицинских имплантантов. Имеется ряд примеров, когда прикрепление пилей вызывало появление сигналов в клетках хозяина. Прикрепление клеток рода Neisseria с помощью пилей типа 4А к рецепторам эпителиальных клеток хозяина вызывает высвобождение запасенного внутриклеточного Са 2+ , известного как сигнал, регулирующий ответы эукариотических клеток. Присоединение Р-пили к уроэпителиальным клеткам может вызвать выход из них керамидов, важных вторичных мессенджеров, способных активировать целый ряд протеинкиназ и фосфатаз, вовлеченных в процесс передачи сигнала. Эти сигналы приводят в конце концов к выделению клетками цитокинов. Пили могут также передавать сигнал внутрь клетки хозяина. Было показано, что прикрепление Р-пили к рецепторам клеток хозяина стимулирует активацию железо-мобилизующих механизмов у уропато- генных Е. coli. Это, вероятно, увеличивает возможности получения железа и выживания клеток возбудителя в дефицитном по железу окружении мочевой системы. Таким образом, изучение функционирования пилей позволит не только глубже понять механизмы колонизации и передачи сигналов, но и вести разработку новых поколений антимикробных агентов для борьбы с патогенными микроорганизмами.

Архитектура пилей варьирует от тонких нитевидных до толстых прочных палочкообразных образований с осевыми отверстиями. Тонкие пили, диаметром не превышающие 2-3 нм, такие как К88 и К99, часто относят к фибриллам. Еще более тонкие пили (Е. coli и Haemophilus influenzae представляют собой сложные структуры, состоящие из толстой палочки с прикрепленной к ней тонкой фибриллой. Расположение пилей может быть разным (по всей поверхности клетки или только на конце). Пили часто расположены перитрихиалыю по поверхности клеток, однако пили типа 4 могут быть локализованы только на одном конце клетки. Одна клетка может иметь фимбрии разных типов. Длина пилей колеблется от 0,1 до 20 мкм, а диаметр - от 2 до 11 нм.

Пили состоят из одного или нескольких типов белковых субъединиц, называемых пилины (фимбрины), которые обычно располагаются но спирали. Для сборки пилей на поверхности клетки все пилины должны быть перенесены через внутреннюю мембрану, периплазму и внешнюю мембрану. Для этого процесса у всех бактерий задействовано два специализированных сборочных белка - периплазматический шаперон и швейцар внешней мембраны. Ансамбль шаперона и швейцара вовлечен в биогенез более чем 30 различных структур, включая сложные пили, тонкие фибриллы и нефибрильные адгезины.

Пили типа 1

Пили типа 1 прочно связаны с клеткой, и для того, чтобы отсоединить их от неё, нужны значительные усилия, большие, нежели для удаления жгутиков или половых пилей. Пили данного типа также устойчивы и к химическим воздействиям - сохраняются в 6 М мочевине , 1 N NаОН , устойчивы к додецилсульфату натрия и трипсину . Эти пили разрушаются только при кипячении в растворе с низким значением , что вызывает необратимую денатурацию белка. Белок , образующий пили общего типа 1, имеет молекулярную массу 17 кДа .

Пили типа 1 располагаются перитрихиально, то есть по всей поверхности бактерии. У одной клетки может быть 50-400 пилей длиной до 1,5 мкм. Диаметр этих пилей около 7 нм, а отверстия - 2,0-2,5 нм.

Формирование пилей общего типа 1 определяется генами , расположенными в хромосоме . Их активность подвержена фазовым вариациям, то есть ген может быть активен либо нет. Обычно в культуре присутствуют как клетки, имеющие много пилей общего типа 1, так и лишенные их. Клетки, находящиеся в той или иной фазе, могут быть легко выведены. Размножению клеток, лишенных пилей, способствует выращивание культуры на агаре , тогда как клетки с пилями получают преимущество при выращивании культуры в жидкой среде без аэрации. При этом они образуют пленку. Пили типа 1 придают бактериям гидрофобность , снижают их электрофоретическую подвижность. Они вызывают агглютинацию эритроцитов за счет того, что такие бактерии приклеиваются к эритроцитам (так же, как к другим клеткам животных), а также к клеткам растений и грибов , к неорганическим частицам. В присутствии маннозы нарушается гемагглютинация и прикрепление бактерий к животным клеткам вообще, поскольку пили типа 1 прикрепляются к поверхностным рецепторам , содержащим маннозу . В присутствии маннозы соответствующие участки пилей заняты её молекулами . Адгезивность пилей зависит также от гидрофобности образующего их белка пилина. С маннозными рецепторами реагируют участки пилей, расположенные по всей их поверхности, тогда как за гидрофобные взаимодействия ответственны окончания пилей.

Пили типа 2

Пили типа 2 сходны с пилями 1-го типа, но не вызывают агглютинации эритроцитов, не способствуют образованию бактериями пленки в жидкой среде. Антигенно они близки к пилям 1-го типа и, по-видимому, представляют собой их мутантную форму. Описан и еще ряд вариантов пилей, близких к пилям 1-го типа. Связи пилей общего типа 1 с патогенностью у штаммов Е. coli не удается обнаружить. У энтеропатогенных штаммов обычно образуются другие пили, кодируемые плазмидными генами. Известно несколько типов таких пилей, причем обнаруживается связь типа пилей со специфичностью бактерий в отношении тех или иных животных.

Другие типы пилей

Пили, известные как антигены К88 и К99, тоньше и лабильнее пилей 1-го типа. Они вызывают гемагглютинацию, устойчивую к маннозе, и способствуют прикреплению бактерий к клеткам кишечного эпителия животных, но не человека . Пили 987Р определяют способность Е. соli прикрепляться к эпителию тонкого кишечника новорожденных свиней ; морфологически они похожи на пили 1-го типа. Пили, определяемые генетическим фактором СFА/1, вызывают агглютинацию человеческих эритроцитов и найдены у патогенных для человека штаммов. Молекулярная масса белков пилинов, кодируемых плазмидными генами, 14,5-26,2 кДа. У энтеропатогенных штаммов Е. соli пили являются одним из факторов патогенности, обеспечивающим им возможность прикрепления к клеткам кишечного эпителия. Колонизация бактериями эпителия способствует эффективному взаимодействию выделяемого ими энтеротоксина с клетками эпителия. В результате происходит нарушение водного обмена ткани, что клинически проявляется как диарея . При этом бактерии энергично размножаются в тонком кишечнике , а затем в большом количестве выносятся в окружающую среду, что способствует их распространению.

Половые пили

Половые пили Е. соli образуются у клеток донорских штаммов, отличающихся от изогенных реципиентных наличием у клеток особого генетического детерминанта - полового фактора, или фактора трансмиссивности, который либо является автономным репликоном (F-фактор), либо входит в состав автономного репликона, либо интегрирован с бактериальной хромосомой. Фактор трансмиссивности находится в составе плазмид - факторов множественной устойчивости к антибиотикам (R-факторы), факторов колициногенности и ряда других плазмид. Половые пили отличаются от пилей общего типа по строению и антигенной специфичности, пили, кодируемые различными генетическими детерминантами, также различны.

Половые F-пили, определяемые F-факторами, представляют собой белковые цилиндры, перпендикулярные поверхности клетки, толщиной 8,5-9,5 нм и длиной до 1,1 мкм. Они легко могут быть отделены от клетки при встряхивании бактериальной массы. F-пили образованы белком с молекулярной массой 11,8 кДа. В составе F-пилина отсутствуют пролин , цистеин , гистидин , аргинин . К молекуле пилина присоединены две фосфатные группы и остаток D-глюкозы , связанные с белком ковалентными связями . Пилин содержит довольно много кислых и гидрофобных аминокислот . Он синтезируется на рибосомах , связанных с цитоплазматической мембраной и в цитоплазме не обнаруживается. Пул пилина, видимо, накапливается в цитоплазматической мембране. Его молекулы в процессе синтеза содержат дополнительную сигнальную последовательность аминокислот , отщепляющуюся при транспорте через мембрану. F-пили легко диссоциируют в растворах додецилсульфата натрия и разрушаются органическими растворителями, что связано с гидрофобностью пилина. Бактерии, имеющие F-пили, приобретают новый антиген, у них изменяется поверхностный заряд. Бактерии с F-пилями малоподвижны, проявляют тенденцию к автоагглютинации, например, при понижении значения рН среды. Это также происходит за счет богатства пилина кислыми и гидрофобными аминокислотами. F-фактор интересен еще и потому, что иногда (примерно в 1 случае из 100000) он встраивается в молекулу основной ДНК клетки-хозяина. Тогда при конъюгации переносится не только F-фактор, но, также и остальная ДНК. Этот процесс занимает примерно 90 минут, но клетки могут расходиться и раньше, до полного обмена ДНК. Такие штаммы постоянно передают всю или большую часть своей ДНК другим клеткам. Эти штаммы называются Hrf-штаммами (High frequency recombination), потому что донорная ДНК таких штаммов рекомбинирует с ДНК реципиента.

Для образования F-пилей необходима активность, по крайней мере, 13 генов. Сборка трубочек пилей происходит на цитоплазматической мембране в местах ее контакта с внешней мембраной. Трубочка пили проходит через слои муреина и внешнюю мембрану. Для сборки и сохранения пилей необходима энергия . Образованию пилей препятствуют цианид , динитрофенол, азид натрия . Возможно, в процессе сборки происходит фосфорилирование пилина. Обычно клетки с дерепрессированным F-фактором образуют 1-2 пили, а в анаэробных условиях и на богатой среде - до 5 пилей. Причина стимуляции пилеобразования в анаэробных условиях неизвестна. У клеток с оторванными пилями быстро отрастают новые, за 30 секунд пиля достигает 1/2 нормальной длины, а полностью формируется за 4-5 мин. Сформированные пили сохраняются на поверхности клетки 4-5 мин, а затем сбрасываются. Это свидетельствует в пользу точки зрения о том, пили - активные образования. Пили, определяемые фактором Соl I, образованы иным пилином, на них не адсорбируются фаги , специфичные для F-пилей, но имеются специфичные для них фаги. Так называемые мужские фаги адсорбируются на половых пилях, РНК -содержащие фаги - на их боковых поверхностях и нитчатые фаги, содержащие одноцепочечную ДНК, - на кончиках этих пилей. Нитчатый фаг препятствует конъюгации.

При конъюгации к реципиентной клетке присоединяется конец половой пили, при этом рецептором служит белок внешней мембраны реципиентной клетки. Сначала этот контакт не очень прочный и легко может быть нарушен при гидродинамических воздействиях. При этом пары распадаются при множественном заражении РНК-содержащими фагами или в присутствии ионов Zn 2+ . Через несколько минут контакт становится более прочным, происходит сближение клеток и образование между ними цитоплазматического мостика. Имеются данные, свидетельствующие о том, что передача ДНК может происходить и без образования цитоплазматического мостика, а непосредственно через отверстие в пиле. Инактивация пилей антисывороткой и любые повреждающие их воздействия приводят к нарушению процесса конъюгации, в то время как нарушение целостности внешней мембраны или муреинового слоя до некоторого предела влияют на донорские свойства клетки, имеющей пили. После установления контакта с реципиентной клеткой черв пилю в донорскую клетку передается сигнал, вызывающий начало конъюгационного синтеза ДНК. Механизм работы половых пилей еще окончательно не установлен. Ряд наблюдений свидетельствует в пользу модели, предполагающей активную функцию пилей. Согласно этой точке зрения после установления контакта с клеткой реципиента или с вирусом пиля сокращается или втягивается в клетку. Эта модель подтверждается как косвенными, так и прямыми наблюдениями. На электронно-микроскопических препаратах можно проследить, как после адсорбции нитчатого мужского фага на их кончиках пили укорачиваются, а затем нити фага оказываются на поверхности клетки. Сокращение пилей вызыват KCN или арсенат . После воздействия этими ингибиторами пили не обнаруживаются ни на поверхности клеток, ни в окружающей среде, но можно наблюдать адсорбцию на поверхности клеток мужских фагов и антител , специфичных к концам пилей, то есть их кончики, видимо, продолжают выступать над поверхностью клетки. При фаговой инфекции в дальнейшем происходит растворение белковой оболочки нитчатого фага в цитоплазматической мембране бактерии и освобождение его ДНК в цитоплазму. При инфицировании РНК-содержащими мужскими фагами сначала образуется комплекс фаговой РНК с пилином, а фаговый капсид освобождается в среду.

Обычно синтез пилина находится под контролем цитоплазматических репрессоров. В некоторых случаях удается наблюдать определенные закономерности в регуляции образования пилей. Так, в случае Соl I-фактора каждая клетка, получившая при конъюгации плазмиду Соl I, образует пили, их активное образование происходит у клеток 4-8 последующих генераций. Однако затем только единичные клетки в популяции образуют пили, поскольку у большинства бактерий синтез пилина репрессирован. Подобная репрессия, как считают, имеет приспособительное значение, поскольку клетки без пилей не чувствительны к мужским бактериофагам, которые могли бы уничтожить всю популяцию. Единичные клетки с пилями способны обеспечить конъюгацию. При контакте таких клеток с популяциями реципиентных бактерий начинается лавинообразное распространение плазмиды, поскольку образование пилей сначала не репрессировано.

Пили типа 1

Пили типа 1 прочно связаны с клеткой, и для того, чтобы отсоединить их от неё, нужны значительные усилия, большие, нежели для удаления жгутиков или половых пилей. Пили данного типа также устойчивы и к химическим воздействиям - сохраняются в 6 М мочевине , 1 М NаОН , устойчивы к додецилсульфату натрия и трипсину . Эти пили разрушаются только при кипячении в растворе с низким значением , что вызывает необратимую денатурацию белка . Белок , образующий пили общего типа 1, имеет молекулярную массу 17 кДа .

Пили типа 2

Другие типы пилей

Половые пили

Для образования F-пилей необходима активность, по крайней мере, 13 генов. Сборка трубочек пилей происходит на цитоплазматической мембране в местах её контакта с внешней мембраной. Трубочка пили проходит через слои муреина и внешнюю мембрану. Для сборки и сохранения пилей необходима энергия . Образованию пилей препятствуют цианид , динитрофенол , азид натрия . Возможно, в процессе сборки происходит фосфорилирование пилина. Обычно клетки с дерепрессированным F-фактором образуют 1-2 пили, а в анаэробных условиях и на богатой среде - до 5 пилей. Причина стимуляции пилеобразования в анаэробных условиях неизвестна. У клеток с оторванными пилями быстро отрастают новые, за 30 секунд пиля достигает 1/2 нормальной длины, а полностью формируется за 4-5 мин. Сформированные пили сохраняются на поверхности клетки 4-5 мин, а затем сбрасываются. Это свидетельствует в пользу точки зрения о том, пили - активные образования. Пили, определяемые фактором Соl I, образованы иным пилином, на них не адсорбируются фаги , специфичные для F-пилей, но имеются специфичные для них фаги. Так называемые мужские фаги адсорбируются на половых пилях, РНК -содержащие фаги - на их боковых поверхностях и нитчатые фаги, содержащие одноцепочечную ДНК, - на кончиках этих пилей. Нитчатый фаг препятствует конъюгации.

Половые пили обычно образуют только активно растущие клетки, клетки из культуры, находящейся в стационарной фазе роста, обычно лишены пилей и являются плохими донорами.

Как уже было отмечено, существует много более или менее различающихся плазмид, способных определять образование половых пилей, которые также несколько различаются. Рецепторы на поверхности реципиентных клеток обладают разной степенью сродства к разным пилям, что может сильно влиять на эффективность конъюгации бактерий.

Пили, подобные пилям E. coli , образуют и другие представители Enterobacteriaceae . Половые пили имеют Vibrio , Pasteurella , Aeromonas , Pseudomonas .

Структура бактерий хорошо изучена с помощью электронной микроскопии целых клеток и их ультратонких срезов, а также других методов. Бактериальную клетку окружает оболочка, состоящая из клеточной стенки и цитоплазматической мембраны. Под оболочкой находится протоплазма, состоящая из цитоплазмы с включениями и наследственного аппарата - аналога ядра, называемого нуклеоидом (рис. 2.2). Имеются дополнительные структуры: капсула, микрокапсула, слизь, жгутики, пили. Некоторые бактерии в неблагоприятных условиях способны образовывать споры.

Рис. 2.2. Структура бактериальной клетки: 1 - капсула; 2 - клеточная стенка; 3 - цитоплазматическая мембрана; 4 - мезосомы; 5 - нуклеоид; 6 - плазмида; 7 - рибосомы; 8 - включения; 9 - жгутик; 10 - пили (ворсинки)

Клеточная стенка - прочная, упругая структура, придающая бактерии определенную форму и вместе с подлежащей цитоплазматической мембраной сдерживающая высокое осмотическое давление в бактериальной клетке. Она участвует в процессе деления клетки и транспорте метаболитов, имеет рецепторы для бактериофагов, бактериоцинов и различных веществ. Наиболее толстая клеточная стенка у грамположительных бактерий (рис. 2.3). Так, если толщина клеточной стенки грамотрицательных бактерий около 15-20 нм, то у грамположительных она может достигать 50 нм и более.

Основу клеточной стенки бактерий составляет пептидогликан. Пептидогликан является полимером. Он представлен параллельными полисахаридными гликановыми цепями, состоящими из повторяющихся остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных гликозидной связью. Эту связь разрывает лизоцим, являющийся ацетилмурамидазой.

К N-ацетилмурамовой кислоте ковалентными связями присоединен тетрапептид. Тетрапептид состоит из L-аланина, который связан с N-ацетилмурамовой кислотой; D-глутамина, который у грамположительных бактерий соединен с L-лизином, а у грамотри-

Рис. 2.3. Схема архитектоники клеточной стенки бактерий

цательных бактерий - с диаминопимелиновой кислотой (ДАП), которая представляет собой предшественник лизина в процессе бактериального биосинтеза аминокислот и является уникальным соединением, присутствующим только у бактерий; 4-й аминокислотой является D-аланин (рис. 2.4).

В клеточной стенке грамположительных бактерий содержится небольшое количество полисахаридов, липидов и белков. Основным компонентом клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан (муреин, мукопептид), составляющий 40-90% массы клеточной стенки. Тетрапептиды разных слоев пептидогликана у грамположительных бактерий соединены друг с другом полипептидными цепочками из 5 остатков глицина (пентаглицина), что придает пептидогликану жесткую геометрическую структуру (рис. 2.4, б). С пептидогликаном ктеточной стенки грамположительных бактерий ковалентно связаны тейхоевые кислоты (от греч. tekhos - стенка), молекулы которых представляют собой цепи из 8-50 остатков глицерола и рибитола, соединенных фосфатными мостиками. Форму и прочность бактериям придает жесткая волокнистая структура многослойного, с поперечными пептидными сшивками пептидогликана.

Рис. 2.4. Структура пептидогликана: а - грамотрицательные бактерии; б - грамположительные бактерии

Способность грамположительных бактерий при окраске по Граму удерживать генциановый фиолетовый в комплексе с йодом (сине-фиолетовая окраска бактерий) связана со свойством многослойного пептидогликана взаимодействовать с красителем. Кроме этого последующая обработка мазка бактерий спиртом вызывает сужение пор в пептидогликане и тем самым задерживает краситель в клеточной стенке.

Грамотрицательные бактерии после воздействия спиртом утрачивают краситель, что обусловлено меньшим количеством пептидогликана (5-10% массы клеточной стенки); они обесцвечиваются спиртом, и при обработке фуксином или сафранином приобретают красный цвет. Это связано с особенностями строения клеточной стенки. Пептидогликан в клеточной стенке грамотрицательных бактерий представлен 1-2 слоями. Тетрапептиды слоев соединены между собой прямой пептидной связью между аминогруппой ДАП одного тетрапептида и карбоксильной группой D-аланина тетрапептида другого слоя (рис. 2.4, а). Кнаружи от пептидогликана расположен слой липопротеина, соединенный с пептидогликаном через ДАП. За ним следуетнаружная мембрана клеточной стенки.

Наружная мембрана является мозаичной структурой, представленной липополисахаридами (ЛПС), фосфолипидами и белками. Внутренний слой ее представлен фосфолипидами, а в наружном слое расположен ЛПС (рис. 2.5). Таким образом, наружная мем-

Рис. 2.5. Структура липополисахарида

брана асимметрична. ЛПС наружной мембраны состоит из трех фрагментов:

Липида А - консервативной структуры, практически одинаковой у грамотрицательных бактерий. Липид А состоит из фосфорилированных глюкозоаминовых дисахаридных единиц, к которым прикреплены длинные цепочки жирных кислот (см. рис. 2.5);

Ядра, или стержневой, коровой части (от лат. core - ядро), относительно консервативной олигосахаридной структуры;

Высоковариабельной О-специфической цепи полисахарида, образованной повторяющимися идентичными олигосахаридными последовательностями.

ЛПС заякорен в наружной мембране липидом А, обусловливающим токсичность ЛПС и отождествляемым поэтому с эндотоксином. Разрушение бактерий антибиотиками приводит к освобождению большого количества эндотоксина, что может вызвать у больного эндотоксический шок. От липида А отходит ядро, или стержневая часть ЛПС. Наиболее постоянной частью ядра ЛПС является кетодезоксиоктоновая кислота. О-специфическая полисахаридная цепь, отходящая от стержневой части молекулы ЛПС,

состоящая из повторяющихся олигосахаридных единиц, обусловливает серогруппу, серовар (разновидность бактерий, выявляемая с помощью иммунной сыворотки) определенного штамма бактерий. Таким образом, с понятием ЛПС связаны представления об О-антигене, по которому можно дифференцировать бактерии. Генетические изменения могут привести к дефектам, укорочению ЛПС бактерий и появлению в результате этого шероховатых колоний R-форм, теряющих О-антигенную специфичность.

Не все грамотрицательные бактерии имеют полноценную О-специфическую полисахаридную цепь, состоящую из повторяющихся олигосахаридных единиц. В частности, бактерии рода Neisseria имеют короткий гликолипид, который называется липоолигосахаридом (ЛОС). Он сравним с R-формой, потерявшей О-антигенную специфичность, наблюдаемой у мутантных шероховатых штаммов E. coli. Структура ЛОС напоминает структуру гликосфинголипида цитоплазматической мембраны человека, поэтому ЛОС мимикрирует микроб, позволяя ему избегать иммунного ответа хозяина.

Белки матрикса наружной мембраны пронизывают ее таким образом, что молекулы белка, называемыепоринами, окаймляют гидрофильные поры, через которые проходят вода и мелкие гидрофильные молекулы с относительной массой до 700 Д.

Между наружной и цитоплазматической мембраной находится периплазматическое пространство, или периплазма, содержащая ферменты (протеазы, липазы, фосфатазы, нуклеазы, β-лактамазы), а также компоненты транспортных систем.

При нарушении синтеза клеточной стенки бактерий под влиянием лизоцима, пенициллина, защитных факторов организма и других соединений образуются клетки с измененной (часто шаровидной) формой: протопласты - бактерии, полностью лишенные клеточной стенки; сферопласты - бактерии с частично сохранившейся клеточной стенкой. После удаления ингибитора клеточной стенки такие измененные бактерии могут реверсировать, т.е. приобретать полноценную клеточную стенку и восстанавливать исходную форму.

Бактерии сфероили протопластного типа, утратившие способность к синтезу пептидогликана под влиянием антибиотиков или других факторов и способные размножаться, называются L-формами (от названия Института им. Д. Листера, где они впер-

вые были изучены). L-формы могут возникать и в результате мутаций. Они представляют собой осмотически чувствительные, шаровидные, колбовидные клетки различной величины, в том числе и проходящие через бактериальные фильтры. Некоторые L-формы (нестабильные) при удалении фактора, приведшего к изменениям бактерий, могут реверсировать, возвращаясь в исходную бактериальную клетку. L-формы могут образовывать многие возбудители инфекционных болезней.

Цитоплазматическая мембрана при электронной микроскопии ультратонких срезов представляет собой трехслойную мембрану (2 темных слоя толщиной по 2,5 нм каждый разделены светлым - промежуточным). По структуре она похожа на плазмолемму клеток животных и состоит из двойного слоя липидов, главным образом фосфолипидов, с внедренными поверхностными, а также интегральными белками, как бы пронизывающими насквозь структуру мембраны. Некоторые из них являются пермеазами, участвующими в транспорте веществ. В отличие от эукариотических клеток, в цитоплазматической мембране бактериальной клетки отсутствуют стеролы (за исключением микоплазм).

Цитоплазматическая мембрана является динамической структурой с подвижными компонентами, поэтому ее представляют как мобильную текучую структуру. Она окружает наружную часть цитоплазмы бактерий и участвует в регуляции осмотического давления, транспорте веществ и энергетическом метаболизме клетки (за счет ферментов цепи переноса электронов, аденозинтрифосфатазы - АТФазы и др.). При избыточном росте (по сравнению с ростом клеточной стенки) цитоплазматическая мембрана образует инвагинаты - впячивания в виде сложно закрученных мембранных структур, называемые мезосомами. Менее сложно закрученные структуры называются внутрицитоплазматическими мембранами. Роль мезосом и внутрицитоплазматических мембран до конца не выяснена. Предполагают даже, что они являются артефактом, возникающим после приготовления (фиксации) препарата для электронной микроскопии. Тем не менее считают, что производные цитоплазматической мембраны участвуют в делении клетки, обеспечивая энергией синтез клеточной стенки, принимают участие в секреции веществ, спорообразовании, т.е. в процессах с высокой затратой энергии. Цитоплазма занимает основной объем бактери-

альной клетки и состоит из растворимых белков, рибонуклеиновых кислот, включений и многочисленных мелких гранул - рибосом, ответственных за синтез (трансляцию) белков.

Рибосомы бактерий имеют размер около 20 нм и коэффициент седиментации 70S, в отличие от 80S-рибосом, характерных для эукариотических клеток. Поэтому некоторые антибиотики, связываясь с рибосомами бактерий, подавляют синтез бактериального белка, не влияя на синтез белка эукариотических клеток. Рибосомы бактерий могут диссоциировать на две субъединицы: 50S и 30S. рРНК - консервативные элементы бактерий («молекулярные часы» эволюции). 16S-рРНК входит в состав малой субъединицы рибосом, а 23S-рРНК - в состав большой субъединицы рибосом. Изучение 16S рРНК является основой геносистематики, позволяя оценить степень родства организмов.

В цитоплазме имеются различные включения в виде гранул гликогена, полисахаридов, β-оксимасляной кислоты и полифосфатов (волютин). Они накапливаются при избытке питательных веществ в окружающей среде и выполняют роль запасных веществ для питания и энергетических потребностей.

Волютин обладает сродством к основным красителям и легко выявляется с помощью специальных методов окраски (например, по Нейссеру) в виде метахроматических гранул. Толуидиновым синим или метиленовым голубым волютин окрашивается в краснофиолетовый цвет, а цитоплазма бактерии - в синий. Характерное расположение гранул волютина выявляется у дифтерийной палочки в виде интенсивно прокрашивающихся полюсов клетки. Метахроматическое окрашивание волютина связано с высоким содержанием полимеризованного неорганического полифосфата. При электронной микроскопии они имеют вид электронноплотных гранул размером 0,1-1 мкм.

Нуклеоид - эквивалент ядра у бактерий. Он расположен в центральной зоне бактерий в виде двунитевой ДНК, плотно уложенной наподобие клубка. Нуклеоид бактерий, в отличие от эукариот, не имеет ядерной оболочки, ядрышка и основных белков (гистонов). У большинства бактерий содержится одна хромосома, представленная замкнутой в кольцо молекулой ДНК. Но у некоторых бактерий имеются две хромосомы кольцевой формы (V. cholerae) и линейные хромосомы (см. раздел 5.1.1). Нуклеоид выявляется в световом микроскопе после окраски специфическими для ДНК

методами: по Фельгену или по Романовскому-Гимзе. На электронограммах ультратонких срезов бактерий нуклеоид имеет вид светлых зон с фибриллярными, нитевидными структурами ДНК, связанной определенными участками с цитоплазматической мембраной или мезосомой, участвующими в репликации хромосомы.

Кроме нуклеоида, в бактериальной клетке имеются внехромосомные факторы наследственности - плазмиды (см. раздел 5.1.2), представляющие собой ковалентно замкнутые кольца ДНК.

Капсула, микрокапсула, слизь. Капсула - слизистая структура толщиной более 0,2 мкм, прочно связанная с клеточной стенкой бактерий и имеющая четко очерченные внешние границы. Капсула различима в мазках-отпечатках из патологического материала. В чистых культурах бактерий капсула образуется реже. Она выявляется при специальных методах окраски мазка по Бурри- Гинсу, создающих негативное контрастирование веществ капсулы: тушь создает темный фон вокруг капсулы. Капсула состоит из полисахаридов (экзополисахаридов), иногда из полипептидов, например у сибиреязвенной бациллы она состоит из полимеров D-глутаминовой кислоты. Капсула гидрофильна, включает большое количество воды. Она препятствует фагоцитозу бактерий. Капсула антигенна: антитела к капсуле вызывают ее увеличение (реакция набухания капсулы).

Многие бактерии образуют микрокапсулу - слизистое образование толщиной менее 0,2 мкм, выявляемое лишь при электронной микроскопии.

От капсулы следует отличать слизь - мукоидные экзополисахариды, не имеющие четких внешних границ. Слизь растворима в воде.

Мукоидные экзополисахариды характерны для мукоидных штаммов синегнойной палочки, часто встречающихся в мокроте больных кистозным фиброзом. Бактериальные экзополисахариды участвуют в адгезии (прилипании к субстратам); их еще называют гликокаликсом.

Капсула и слизь предохраняют бактерии от повреждений, высыхания, так как, являясь гидрофильными, хорошо связывают воду, препятствуют действию защитных факторов макроорганизма и бактериофагов.

Жгутики бактерий определяют подвижность бактериальной клетки. Жгутики представляют собой тонкие нити, берущие на-

чало от цитоплазматической мембраны, имеют большую длину, чем сама клетка. Толщина жгутиков 12-20 нм, длина 3-15 мкм. Они состоят из трех частей: спиралевидной нити, крюка и базального тельца, содержащего стержень со специальными дисками (одна пара дисков у грамположительных и две пары у грамотрицательных бактерий). Дисками жгутики прикреплены к цитоплазматической мембране и клеточной стенке. При этом создается эффект электромотора со стержнем - ротором, вращающим жгутик. В качестве источника энергии используется разность протонных потенциалов на цитоплазматической мембране. Механизм вращения обеспечивает протонная АТФ-синтетаза. Скорость вращения жгутика может достигать 100 об/с. При наличии у бактерии нескольких жгутиков они начинают синхронно вращаться, сплетаясь в единый пучок, образующий своеобразный пропеллер.

Жгутики состоят из белка - флагеллина (flagellum - жгутик), являющегося антигеном - так называемый Н-антиген. Субъединицы флагеллина закручены в виде спирали.

Число жгутиков у бактерий разных видов варьирует от одного (монотрих) у холерного вибриона до десятка и сотен, отходящих по периметру бактерии (перитрих), у кишечной палочки, протея и др. Лофотрихи имеют пучок жгутиков на одном из концов клетки. Амфитрихи имеют по одному жгутику или пучку жгутиков на противоположных концах клетки.

Жгутики выявляют с помощью электронной микроскопии препаратов, напыленных тяжелыми металлами, или в световом микроскопе после обработки специальными методами, основанными на протравливании и адсорбции различных веществ, приводящих к увеличению толщины жгутиков (например, после серебрения).

Ворсинки, или пили (фимбрии) - нитевидные образования, более тонкие и короткие (3-10 нм * 0,3-10 мкм), чем жгутики. Пили отходят от поверхности клетки и состоят из белка пилина. Известно несколько типов пилей. Пили общего типа отвечают за прикрепления к субстрату, питание и водно-солевой обмен. Они многочисленны - несколько сотен на клетку. Половые пили (1-3 на клетку) создают контакт между клетками, осуществляя между ними передачу генетической информации путем конъюгации (см. главу 5). Особый интерес представляют пили IV типа, у которых концы обладают гидрофобностью, в результате чего они закручиваются, эти пили называют еще кудряшками. Располага-

ются они по полюсам клетки. Эти пили встречаются у патогенных бактерий. Они обладают антигенными свойствами, осуществляют контакт бактерии с клеткой-хозяином, участвуют в образовании биопленки (см. главу 3). Многие пили являются рецепторами для бактериофагов.

Споры - своеобразная форма покоящихся бактерий с грамположительным типом строения клеточной стенки. Спорообразующие бактерии рода Bacillus, у которых размер споры не превышает диаметр клетки, называются бациллами. Спорообразующие бактерии, у которых размер споры превышает диаметр клетки, отчего они принимают форму веретена, называются клостридиями, например бактерии рода Clostridium (от лат.Clostridium - веретено). Споры кислотоустойчивы, поэтому окрашиваются по методу Ауески или по методу Циля-Нельсена в красный, а вегетативная клетка - в синий цвет.

Спорообразование, форма и расположение спор в клетке (вегетативной) являются видовым свойством бактерий, что позволяет отличать их друг от друга. Форма спор бывает овальной и шаровидной, расположение в клетке - терминальное, т.е. на конце палочки (у возбудителя столбняка), субтерминальное - ближе к концу палочки (у возбудителей ботулизма, газовой гангрены) и центральное (у сибиреязвенной бациллы).

Процесс спорообразования (споруляция) проходит ряд стадий, в течение которых часть цитоплазмы и хромосома бактериальной вегетативной клетки отделяются, окружаясь врастающей цитоплазматической мембраной, - образуется проспора.

В протопласте проспоры находятся нуклеоид, белоксинтезирующая система и система получения энергии, основанная на гликолизе. Цитохромы отсутствуют даже у аэробов. Не содержится АТФ, энергия для прорастания сохраняется в форме 3-глицеринфосфата.

Проспору окружают две цитоплазматические мембраны. Слой, окружающий внутреннюю мембрану споры, называется стенкой споры, он состоит из пептидогликана и является главным источником клеточной стенки при прорастании споры.

Между наружной мембраной и стенкой споры формируется толстый слой, состоящий из пептидогликана, имеющего много сшивок, - кортекс.

Кнаружи от внешней цитоплазматической мембраны расположена оболочка споры, состоящая из кератиноподобных белков, со-

держащих множественные внутримолекулярные дисульфидные связи. Эта оболочка обеспечивает резистентность к химическим агентам. Споры некоторых бактерий имеют дополнительный покров -экзоспориум липопротеиновой природы. Таким образом формируется многослойная плохо проницаемая оболочка.

Спорообразование сопровождается интенсивным потреблением проспорой, а затем и формирующейся оболочкой споры дипиколиновой кислоты и ионов кальция. Спора приобретает термоустойчивость, которую связывают с наличием в ней дипиколината кальция.

Спора долго может сохраняться из-за наличия многослойной оболочки, дипиколината кальция, низкого содержания воды и вялых процессов метаболизма. В почве, например, возбудители сибирской язвы и столбняка могут сохраняться десятки лет.

В благоприятных условиях споры прорастают, проходя три последовательные стадии: активации, инициации, вырастания. При этом из одной споры образуется одна бактерия. Активация - это готовность к прорастанию. При температуре 60-80 °С спора активируется для прорастания. Инициация прорастания длится несколько минут. Стадия вырастания характеризуется быстрым ростом, сопровождающимся разрушением оболочки и выходом проростка.

Подвижность бактерий определяют микроскопией препаратов в «раздавленной » или «висячей » капле. Способность к движению можно определять также после внесения культуры бактерий уколом в столбик полужидкого агара (подвижные виды растут по всей толще среды, неподвижные - по уколу) или посевом бактерий в водный конденсат скошенного столбика агара (подвижные виды переплывают из конденсата на поверхность среды и колонизируют её), либо определяют способность бактерий давать «феномен роения ».

Микроворсинки бактерий. Фимбрии бактерий. F-пили (секс-пили) бактерий. Клеточная оболочка бактерий. Гликокаликс.

Помимо жгутиков , поверхностьмногих бактерий покрыта цитоплазматическими выростами -микроворсинками . Обычно это волоски (числом от 10 до нескольких тысяч) толщиной 3-25 нм и длиной до 12 мкм.Микроворсинки встречают как у подвижных, так и у неподвижных бактерий. Эти выросты способствуют увеличению площади поверхности бактериальной клетки, что дает ей дополнительные преимущества в утилизации питательных веществ из окружающей среды. Известны специализированные микроворсинки -фимбрии ипили .

Фимбрии бактерий [от лат. fimbria, бахрома]. Многие грамотрицательные бактерии имеют длинные и тонкие микроворсинки, пронизывающие клеточную стенку. Образующие их белки формируют спиралевидную нить. Основнаяфункция фимбрии - прикрепление бактерий к субстратам (например, к поверхности слизистых оболочек), что делает их важным фактором колонизации и патогенности.

F-пили бактерий [от англ. fertility, плодовитость, + лат. pilus, волосок], или «секс-пили », - жёсткие цилиндрические образования, участвующие в конъюгации бактерий. Пили впервые обнаружены у Escherichia coli K12, то есть у штаммов, содержащихF-фактор (см. тему «Плазмиды»). Обычно клетка снабжена 1-2 пилями, имеющими вид полых белковых трубочек длиной 0,5-10 мкм; нередко они имеют шаровидное утолщение на конце. БольшинствоF-пилей образует специфический белок -пилин . Образование пилей кодируют плазмиды. Их идентифицируют с помощью донорспецифических бактериофагов, адсорбирующихся на пилях и лизирующих клетки.

Клеточная оболочка бактерий.

У большинства бактерий клеточная оболочка состоит из клеточной стенки и находящейся под ней ЦПМ. С долей условности клеточную оболочку можно назвать живой кожей бактерий в противоположность мёртвому веществу капсулы.Клеточную оболочку можно сравнить с тонкой и эластичной, но в то же время прочной покрышкой футбольного мяча. Как мячу придаёт упругость хорошо накачанная футбольная камера, так и клеточной стенке бактерий дополнительную упругость придаёт внутреннее (тургорное) давление цитоплазмы, способное достигать у грамположительных бактерий 30 атм. Некоторые бактерии в качестве наружного слоя клеточной стенки дополнительно имеют внешнюю мембрану-гликокаликс .

Гликокаликс [от греч. gfykys, сладкий, + kalyx, раковина] образован переплетением полисахаридных волокон (декстраны и леваны). Его не обнаруживают при выращивании на искусственных питательных средах. Основная функция гликокаликса - адгезия к различным субстратам. Например, благодаря гликокаликсу Streptococcus mutatis способен прочно прикрепляться к зубной эмали.

Клеточная стенка бактерий. Функции клеточной стенки. Строение клеточной стенки бактерии. Структура пептидогликана.

Основные функции клеточной стенки следующие.

Клеточная стенка защищает бактерии от внешних воздействий, придаёт им характерную форму, поддерживает постоянство внутренней среды и участвует в делении.

Через клеточную стенку бактерий осуществляется транспорт питательных веществ и выделение метаболитов,

На поверхности клеточной стенки располагаются рецепторы для бактериофагов, бактериоцинов и различных химических веществ.

Структура и состав элементов клеточной стенки определяет антигенную характеристику бактерий (по структуре О- и Vi-Аг).

Клеточная стенка способна по-разному воспринимать красители; на этом основаны тинкториальные свойства бактерий.

Нарушение синтеза компонентов клеточной стенки приводит к гибели бактерии или образованиюL-форм.